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基于图像的菌丝体衍生生物材料霉菌易感性评估,用于可持续建筑

摘要

向圆形建筑材料的转变需要充分了解其生物耐久性。菌丝基复合材料(MBCs)是通过真菌生物技术生产的生物制造材料,其中木质纤维素基底上的真菌生长通过定殖和消化过程形成天然粘合剂。虽然MBC已成为有前景的低碳绝缘材料,但评估其耐久性,特别是抗霉能力,是研究的一个关键空白。标准的霉菌评估方法通常依赖主观的视觉评分,而由于MBC表面的固有异质性和自然颜色的变异,这种主观性对MBC来说是一大挑战。本研究探讨由大麻刺和灵芝菌丝体在高湿度湿润条件下产生的MBCs霉菌的易感性。所有标本均观察到霉菌生长,证实了在湿气胁迫下对生物基材料进行常规检测的必要性。为解决主观评估的局限性,开发了一种基于图像的非破坏性方法,采用灰阶共现矩阵(GLCM)对比度指标,利用潜伏期拍摄的延时图像量化表面纹理随时间的变化。通过感知调查评估的人类视觉发现霉菌发病,与GLCM得出的估计相符,验证了该方法捕捉生物相关表面变化的能力。该方法为监测异质生物基材料的模具进展提供了低成本、可扩展且客观的工具,并为建筑中生物材料的耐久性测试和安装后评估提供改进基础。

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介绍

霉菌在建筑材料上的生长带来显著的健康风险,并与严重的社会和经济后果相关[1,2,3,4]。为减轻这些影响,慎重的材料选择和适当的建筑设计至关重要[5, 6]。随着建筑行业探索利用生物基材料减少隐含碳排放,迫切需要评估和管理这些材料霉菌发生的风险[7, 8]。生物基材料因其化学成分(主要包括纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质)能够作为真菌的营养来源,并为霉菌生长提供有利条件[9, 10]。这对其在建筑环境中的耐久性和安全性有影响[11]。霉菌是一类表现出丝状生长和大量孢子产出的真菌的统称[12]。

在新兴的生物基材料中,菌丝基复合材料(MBCs)作为传统保温材料(如膨胀聚苯乙烯和矿物棉)的可持续绝缘替代品而受到关注[13, 14],后者具有较高的隐含碳且依赖有限资源[15, 16]。菌丝体是真菌的营养部分;它是由称为菌丝的丝状结构组成的网络[17]。MBCs通过在木质纤维素基质上培养真菌菌丝体产生,真菌可以部分消化这些基质并作为养分来源[18]。生长过程中,菌丝体形成天然粘合剂,将基底结合形成材料,随后在烤箱中干燥以杀死真菌,留下非生命的生物基物质[19]。近期研究探讨了真菌种类、基材和生长条件对MBC热力学性能的影响,取得了令人期待的防火安全和生命周期评估结果,此外多项研究和多家MBC绝热材料公司已证明其热导率低,尽管这些材料尚未商业化[18, 20,21,22]。

然而,霉菌易感性仍是MBCs及其他生物基材料面临的关键且尚未充分探索的风险。霉菌需要水分、温度和养分才能生长,在室内条件下很容易侵蚀纤维素材料[10]。它们的生长需要自由的水和养分来源,因此某些建筑材料在高湿度条件下或因漏水或天气事件而受潮时,可能存在霉菌滋生的风险[8]。相当一部分住宅会经历霉菌或潮湿,已知对居住者健康有影响,尤其是在弱势群体中[23,24,25]。尽管商业生物基产品可能包含抗真菌处理,但普遍建议仍是环境控制以防止霉菌生长,特别是降低湿度和温度,并允许通风[26]。然而,这并非总是可行,尤其是在极端天气下,随着建筑通风减少以减少热传导,这一目标可能变得更加困难;因此,材料选择同样重要[27,28,29,30]。然而,关于绝缘材料中霉菌形成的研究有限,安装后监测也很少进行[31]。此外,现行法规未能充分应对新材料的霉菌风险,标准的霉菌易感性测试并非所有材料的强制要求。

虽然有必要加强对绝缘材料霉菌易感性的标准化测试,并便于比较和透明,但当前标准存在一些局限性,尤其是在考虑MBC及类似材料时。当前的霉菌易感性测试标准高度依赖主观评分,通常将霉菌覆盖度评分从0到5分之间分配。虽然这些方法对初步材料筛查有用,但容易产生观察者偏差,不适合追踪时间依赖的霉菌进展,且缺乏研发所需的分辨率[32]。这对生物基和非均质材料如MBC尤为严重,自然颜色和表面变异性会掩盖早期霉菌生长,并在视觉评估中引入更多主观性[33]。

为了解决这些局限性,需要非主观、连续且可扩展的霉菌评估方法。基于图像的分析提供了一种有前景的替代方案,能够客观评估霉菌的起始和进展,无论是在实验室检测中,还是在高风险事件(如水渗入)后的现场监测中。此类方法对生物基材料尤为重要,传统评分系统可能无法检测细微变化或在样品间获得一致结果。现有基于图像的霉菌评估方法主要依赖于视觉或光光度测量原理,包括灰度阈值测量、颜色分割和表面覆盖度量化[34,35,36,37]。虽然这些方法为主观视觉评分提供了更客观的替代方案,但它们更适合在相对均匀的材料中,霉菌菌落呈现出明显的颜料对比。对于异质生物基底物,如菌丝基复合材料,颜色和图案的自然变化可能遮蔽早期生长,限制覆盖率或强度分析的灵敏度。因此,本研究采用灰级共现矩阵(GLCM)对比度量化霉菌发育。与基于面积的分割方法不同,GLCM对比检测的是由于像素间异质性增加而导致局部表面纹理的变化——这一特征在可见菌落形成前可能发生变化。这提供了一种非主观、低成本的早期霉斑相关表面变化检测方法,超越了现有的视觉或光光度测量方法,并为表面本身具有变异性的材料带来了特别的益处。

本研究针对这些知识缺口和实际挑战进行了解决,并以以下关键目标实现:

  • 评估菌丝体复合标本在湿润和高湿度条件下对霉菌生长的敏感性
  • 开发并测试一种非主观方法,用于追踪非均质材料上的霉菌生长
  • 比较霉菌生长的客观图像指标与人类视觉感知

为实现这些目标,采用大麻刀和灵芝菌丝体制作MBC绝缘样品,并按照BS EN 17886:2023的方案,用成霉真菌的孢子悬浮液接种。标本被润湿并在高湿度下孵育10天,同时采用延时摄影捕捉标本霉菌生长的进展。为客观追踪霉菌生长,图像序列采用灰级共现矩阵(GLCM)指标分析,以量化真菌定殖相关表面纹理变化。这些客观指标随后与通过定制视觉感知调查获得的人类视觉感知进行比较,该调查中参与者评估了相同的图像系列以寻找可见的霉菌迹象。本研究提供了关于菌丝基复合材料在高湿度条件下和湿润事件下的敏感性的重要实证结果,并进一步探讨了风险管理所需的生物基材料耐久性。此外,本研究展示了基于图像的相对简单分析在远程且非主观地监测模具发育的潜力,能够处理非均质材料,且无需强大或昂贵的成像设备。能够客观地追踪真菌定殖随时间的变化,是对传统主观方法的宝贵进步,可以发展成常规霉菌易感性检测的标准化方法,鉴于对多种生物基建筑材料(包括MBCs)的兴趣日益增加,这些材料的成分可能因物种和基材不同而多样(因此在之前需要单独进行霉菌易感性测试)不同的产品可以在家庭中安全使用)。这种方法为改进防霉测试方案提供了实用基础,并通过更可靠的质量控制、认证和安装后评估,支持生物基材料在建筑中的更广泛整合。最终,研究结果强调了主动监测和材料评估策略在确保天然保温产品在真实环境中安全持久应用的重要性。

方法

本节介绍了用于菌丝体复合材料生产、热导率测量、霉菌易感性评估、图像分析、视觉感知测试和数据分析的方法。

1、基于菌丝体的复合材料生产

MBC标本的制备程序如图所示。1. 预切、未处理的大麻刀由商业供应商采购,颗粒尺寸约为10×5 × 2毫米,密度为110 kg/m大麻匕首首先浸泡在水中24小时,随后排干。浸泡好的大麻刀随后与纯白面粉以10:1(玉米刀:面粉)的重量比例混合。该底物混合物在121 C和15 psi的高压灭菌器中消毒60分钟。

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菌丝体谷物产卵通过将煮熟并消毒的糙米(在121 C和15 psi高压釜消毒60分钟)中接种灵菌丝体制成。菌丝体在麦芽提取物琼脂(MEA)上以23 C的温度生长,使用MycoPunks(商业供应商)提供的液体培养,并通过ITS1F和ITS4引物进行ITS区域测序确认了物种鉴定。接种的稻米在23 C下孵育5天,实现菌丝定殖。

随后的处理是在层流罩的无菌条件下进行的。绝育基底与定殖的G. curtisii谷物卵以10:1的重量比(底质:卵)混合。混合物被转移到无菌的90毫米直径培养皿中(每个培养皿约30克),并用防腐胶带封口。标本在23 C下孵育5天,直到菌丝体明显覆盖整个基底表面。

在最初的孵化期结束后,定殖的标本被从培养皿中取出,转移到更大的生长容器中(直径120毫米,高度500毫米)。每个容器都覆盖着一层透气膜,以便空气流通。这一二次孵育阶段通过改善生长物周围的通气,促进了菌丝体皮肤的均匀形成。容器在23 C下孵育了3天。

经过共8天的孵育,标本从模具中取出并称重。标本在实验室烤箱中以50C干燥48小时,以杀死活菌并干燥材料。在24小时和36小时记录中间重量,以监测水分流失并确认完全干燥。干燥过程使标本质量平均减少了80.3±0.2%。标本影像在36小时后拍摄。干燥后,15个标本立即被转移到无菌容器中,并分配用于霉菌易感性检测。另外5个样品被存放在室温下,随后用于热导率测量。

2、热导率测量

每个试样的热导率均通过热流计测定,符合ASTM C518[39]。对5个标本各进行了五次热分析测试(共25次测试),使用热测测试HFM-25。每个标本在实验室中以室温保存至少一周(约20 ∘C,湿度50%)后进行检测。试样密度也根据ASTM C303在测试前计算[40]。测试在平均温度20 ∘C、板间温差20 ∘C下进行。

3、霉菌易感性测试与图像采集

霉菌易感性测试基于BS EN 17886:2023标准进行,用于评估热绝缘产品对霉菌生长的敏感性[41]。该程序大致遵循标准协议,但对其进行了修改以模拟更极端的环境并加速潜在真菌生长。在这里,在接种后引入了额外的润湿步骤,并调整了孵化温度和相对湿度。图2概述了该方法的步骤。

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本研究用于评估MBC标本霉菌易感性的方法,以及图像分析和人类感知评估以检测标本霉菌生长的起始情况。霉菌易感性测试根据BS EN 17886:2023进行,条件调整,测试湿润条件下的生长(模拟泄漏情景或极端天气事件,旨在加速霉菌生长以便图像采集)。图像分析通过在恒定光照条件下的延时摄影环境中每小时拍摄的每小时图像,确定每个标本的GLCM对比度指标。人类感知评估采用定制调查,参与者被要求指出霉菌首次出现生长的时间段

控制介质采用NaNO制备3(2.0克),KH2邮局4(0.7克),K2高压水务局4(0.3克),KCl(0.5克),MgSO40.7 H2O(0.5克),FeSO40.7 H2O(0.01克)、葡萄糖(30克)和琼脂(15克)在1000毫升去离子水中。培养基通过高压灭菌,温度为115C,灭菌30分钟,然后倒入无菌培养皿中,在无菌条件下凝固。

用于接种的六种真菌菌株来自美国国家自然史博物馆(MNHN):黑曲霉菌5614、绿曲霉菌88–3354、塔拉霉菌(Talaromyces pinophilus 56–1527)、球状毛菌(Chaetomium globosum 4579)、变色曲霉菌(Paecilomyces variotii LCP 79–3210)和曲霉菌5593。通过使用ITS1F和ITS4引物进行ITS区域测序确认了物种鉴定。本研究生成的ITS序列已存入GenBank,编号为PX635291至PX635296。真菌在麦芽提取物琼脂上以23 C培养七天后,进行孢子悬浮液制备。

孢子悬浮液通过在每块板中加入1毫升无菌去离子水,含0.05%(w/v)Tween 80和0.9%(w/v)NaCl,制成孢子悬浮液。孢子通过用无菌接种环轻轻搅动表面来清除。悬浮液被转移到装有玻璃珠的无菌瓶中,并用力摇晃。孢子悬浮液穿过20 μ米的滤纸后,在2000克离心20分钟。上清液被丢弃,沉淀重新悬浮于10毫升无菌去离子水中,含0.05%(w/v)Tween 80和0.9%(w/v)NaCl。离心步骤被重复进行。孢子沉淀被重新悬浮在10毫升的Tween-NaCl溶液中,并彻底摇晃。该过程对六个真菌株中每个菌株重复,以产生六个独立的孢子悬浮。孢子浓度通过马拉塞计数室测定。单个悬浮液被Tween-NaCl溶液稀释,混合得含有\(1.0 \ 10^6\)孢子/mL的最终混合物,即每种真菌种类的\(1.67 \ 10^5\)孢子。

在生物安全柜中,测试样本被放置在单个无菌培养皿中。通过移液管对等于每厘米2的孢子进行1.0 × 乘以10^4\ x 10^4\的孢子,对十个测试样品和三种对照培养基进行接种。孢子悬浮液干燥后,每个标本被1毫升无菌水润湿,随后封闭培养皿并用防腐胶封口。另外,5个MBC对照样本(未添加孢子悬浮液)也被1毫升无菌水润湿。通过将三块MEA板接种孢子悬浮液并以23 C培养,2天后发现霉菌生长,确认了孢子的存活性。

所有样本均置于保持90%相对湿度和25C的生长室中,持续十天。整个孵化期内,舱室持续照明。

为了监测真菌发育,使用位于样本正上方的Apexcam X80 Pro相机(4800万像素分辨率)每60秒拍摄延时摄影。相机固定在固定高度45厘米的夹具架上。环境舱维持了持续的内部照明。潜伏期结束后,样本被取出并使用BS EN 17886:2023中描述的霉菌生长评级系统进行目视评估。这是一个0–3的霉菌评级等级,评级如下:0-无肉眼可见霉菌生长,测试样品表面放大倍率为20倍和50倍;1- 肉眼无霉菌生长,但显微镜放大倍率为20倍和50倍,无法看到霉菌生长;2- 肉眼可见的少量霉菌生长斑点;3- 肉眼可见的霉菌生长密集。此次目视检查用于补充通过图像分析获得的定量数据,并用于比较根据BS EN 17886:2023评估的不同材料的霉菌生长等级,包括未来在不同条件下的MBC测试。

4、图像分析

从实验期间收集的完整延时图像中,选出了部分固定间隔(每60分钟)的帧进行分析。图像处理使用ImageJ(版本1.54j)完成。对于延时序列中捕获的15个MBC样本(10个接种样本和5个对照样本),都开发了定制宏观以自动化分析工作流程。该宏将每张图像转换为8位灰度,应用对应标本表面面积的一致椭圆形兴趣区域(ROI),并提取灰阶共现矩阵(GLCM)特征。由于光照在整个延时成像过程中保持恒定,无需阈值化或强度归一化。

GLCM 纹理度量通过 ImageJ [42] 中的“GLCM 纹理”插件计算,共现矩阵在 0 ∘ 方向 1 像素处计算。从每个ROI中提取了以下特征:角二矩、对比度、相关性、反差分矩和熵。该插件在宏中执行,每个指标的输出值被记录在结构化的CSV文件中,允许在10天孵化期内对纹理开发进行时间跟踪。

灰级共现矩阵(GLCM)是一种用于纹理分析的统计工具,用于量化图像中像素强度之间的空间关系[43]。它捕捉了像素值对之间相对于的频率,这些值之间有明确的距离和方向。具体来说,GLCM是一个方阵,其中每个元素(i, j)表示灰阶i像素相邻j的频率[44]。通过分析该矩阵的结构,可以提取描述表面视觉和结构属性的各种纹理特征,这些特征仅靠均值或方差等一阶统计量无法显现[45]。基于GLCM的分析可以表征异质或有图案的表面,如生物组织、地质材料或基底上的真菌生长[45]。

在GLCM衍生的多种指标中,对比剂可以检测因生物活性引起的表面纹理变化,如霉菌定殖[46],并与其他GLCM衍生指标相关[45]。对比度量化了灰阶局部变化的程度,并对明显的强度差异敏感,因此是描述图像中视觉复杂性和边缘突出度的有效指标。数学上,对比度定义为 \(\text{Contrast} = \sum_{i=0}^{N-1} \sum_{j=0}^{N-1} (i – j)^2 P(i, j)\)),其中 N 是灰阶数,\(P(i, j)\) 是位置 (i, j) 的归一化 GLCM 值,\(((i – j)^2\) 表示像素对间的强度平方差 [45].对比度越高,邻近像素强度差异越大,在本研究背景下,真菌生长更为明显且异质。随着霉菌的发展,会破坏标本表面的均匀外观,导致像素间的差异增加。因此,监测对比度随时间的变化提供了霉菌在样品表面生长进展和空间复杂性的定量指标。

对于每张图像,对比度会根据在 t = 0 时获得的图像对比度进行归一化。

GLCM是通过0∘方向像素距离1计算的。选择了一个像素的距离,因为这反映了相邻像素之间的关系,从而评估图像中最小的结构单元。采用0∘方向,因为标本在成像尺度上无主导方向。提取了四项标准GLCM特征:角二矩、对比度、相关性和熵。选择对比作为进一步分析的主要指标,因为它直接测量局部强度变异性。为评估对比度与其他GLCM特征的关系,采用皮尔逊相关系数(r)量化每张图像对比度与其他GLCM指标的关系。相关性较强,对比度与角二矩的均值为\(r = -0.926 \pm 0.025\),对比度与相关性为\(r = -0.908 \pm 0.024\),对比度与熵的平均值为\(r = 0.958 \pm 0.018\)。这些结果表明,在所选GLCM参数下,对比度相对于其他特征表现一致,因此为GLCM分析提供了可靠的图像纹理描述。

5、视觉感知测试

为评估GLCM对比度指标是否符合人类对霉菌发育的感知,进行了基于感知的评估。从完整的延时摄影图像中,每块标本每隔一小时选取了15个代表性帧,涵盖从无可见霉菌到明显定殖的过渡期。这些图片被用来构建一份自定义调查,用HTML开发并托管在GitHub上。

调查依次为每个标本呈现图像,并要求参与者说明是否可见霉斑(是/否)。当受试者选择“是”(当受试者首次感知可见霉菌时),他们被引导到下一个样本。调查包含清晰的说明,并附有示例,说明MBC上可见霉菌的存在与否。受访者来自研究生和学术人员。共有20名参与者完成了调查。

计算了每个标本人类霉菌检测的平均时间及标准误。为了确定参与者的选择是否反映了视觉线索的反应,而非随机猜测,对每个样本的反应分布进行了卡方拟合度检验。在原假设下,反应分布均匀,表明没有共同的视觉阈值来检测霉菌。与该分布显著偏离被解读为感知共识的证据,支持将汇总调查回答作为对人类霉菌发病感知的无偏估计。

调查还提供了关于人类霉菌生长感知差异及其固有主观性的定量数据,这些数据可用于支持非主观工具在评估生物基材料生物劣化和霉菌易感性方面的必要性。

6、数据处理

GLCM对比度数据通过Savitzky–Golay滤波器(窗口长度=11,多项式阶=3)进行平滑处理,以减少噪声。安装了一个三参数的冈佩茨模型。选择Gompertz模型是因为其适合描述微生物和真菌群体典型的非对称S形生长动力学[47]。模型被限制从基线对比度为1开始,并用非线性最小二乘法拟合到平滑数据,形式为:\(y(t) = A \exp\left( -\exp\left[ -k(t – t_0) \right] \right)\),其中y(t)表示时间t时霉菌生长的程度,A是上渐近线, k 是增长率系数,T0是增长率达到最大值的时间点(即曲线的拐点)[48]。该模型采用非线性最小二乘回归拟合。根据拟合参数,滞后时间λ(定义为快速模具定殖开始前的时间)估计为\(\lambda = t_0 – \frac{1}{k}\),这是根据Gompertz函数的几何解释,其中λ对应拐点切线与时间轴的交点。

选举结果

1、物理和热性能

标本最终密度为77.6±0.7公斤/方米。测试样品的平均热导率(λ)为λ = 0.040±0.001 W/m.K。发现密度与λ之间存在强正相关(R2 = 0.83)。

所产生的MBC在密度、菌丝覆盖率和基质异质性方面表现出良好均匀性,均通过密度测量和视觉评估评估。

2、霉菌易感性评估

图3展示了成功生产的MBC标本及其在孵育期后十个标本上的霉菌生长情况。所有十个菌丝基复合材料(MBC)标本在高湿度湿润条件下均表现出明显霉菌生长,证实了它们在模拟湿气入侵或室内湿度升高环境中易受真菌侵染。图4展示了MBC标本在不同孵育期拍摄图像中霉菌的发育过程。

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本研究中采集并检测霉菌易感性的标本图像。这些样品是直径90毫米、高度15毫米的圆柱体。图像拍摄于延时摄影前后
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MBC标本在孵育期不同时间点拍摄的霉菌发育图像

表1显示了霉菌检测的平均时间(t)d)来自人类感知评估,以及图像在t处测量的对比度d.人类对霉菌发作的感知给出了平均检测时间(td)在标本间,平均时间为145.3至185小时,平均164.0小时±11.7小时。最早被感知的发病发生在标本10,而最晚的发病发生在标本4。观察到参与者反应的差异,标准差为t。d时长从13.2小时到75.1小时不等。这种差异凸显了个体对真菌生长视觉指标敏感度的差异。然而,卡方拟合度检验否认了所有情况下均一致反应分布的虚无假设(p < 0.05),证实参与者对一致的视觉线索作出反应,而非随机猜测。

进行了Bland–Altman分析以评估人类检测时间(t)之间的一致性d)以及GLCM推导的滞后时间(λ)。平均差为3.45小时,显示图像方法没有系统性高估或低估。差异的标准差为12.12小时,95%的一致性界限介于−20.31至27.20小时之间。所有标本均在这些限制范围内,包括最大的差异(标本4),表明两种方法在实际作上具有良好的一致性。相对于240小时潜伏期的狭窄偏差表明GLCM对比剂捕捉的起始时间与人类感知相符。

对照组(未接种)MBCs无明显霉菌生长。成像期间测量的对比值在五个对照标本中均保持稳定。控制1在0.982–1.029(σ=0.011)之间变化,控制2在0.997–1.053(σ=0.014)之间,控制3在1.000–1.041之间(σ=0.008),控制4在0.998–1.017(σ=0.004)之间,控制5在归一化到第一帧后在0.981–1.024(σ=0.012)之间变化。

使用GLCM对比度量的定量纹理分析表明,局部图像对比度的增加与霉菌生长有关。图5显示了每个标本在潜伏期内的相对对比。t处的对比值d,人类检测的平均发病时间因标本而异,数值范围为1.1至6.2。检测时对比度最高的是标本1,该标本也是视觉检测时间变化最早且变化最小的标本之一。相比之下,4号和7号等标本在t值处的对比度较低d,这表明可能存在视觉上不那么明显的定殖,或整体霉菌生长较少。

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图表显示了十个检测样本在潜伏期内测量的相对GLCM对比值。还展示了人类霉菌感知调查的结果,直方图显示了当时表示可感知霉菌的受访者人数

为评估GLCM对比剂作为微生物发育代理的适用性,对比剂数据采用了Gompertz生长模型拟合。图6展示了样品对比度增加的拟合示例。表1显示了整套标本的延迟时间。这使得提取滞后时间(λ)成为可能,该时间定义为指数增长开始前的时间点。装配的延迟时间范围为138.9至185.4小时。与人类检测的发病时间相比,绝对差异在0.3小时到24.7小时之间。平均来看,人类检测发生在估计滞后点6.5小时后,表明GLCM对比剂能在结构变化出现或接近人眼可见之前检测到。在大多数情况下,t之间的差异dλ 均不足10小时,若干标本(如6、9和10)差异不到5小时,分别为1.0%、2.4%和0.2%的百分比差异。这支持了人类视觉阈值与对比度量表捕捉到的表面纹理可测量变化之间的对齐。

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图示了本研究中测试的代表性MBC标本(对应标本2)拟合生长曲线、归一化对比度值及从生长曲线拟合确定的滞后时间。

标本4在t之间差异最大dλ,绝对差24.7小时,偏差13.4%。这可能表明,当表面变化细微或标本异质性时,人类观察者可能无法察觉早期霉菌发育,强化了基于图像的指标在识别可见定殖前的起始阶段的实用性。其他标本中观察到的更接近一致性表明,GLCM对比剂可以作为真菌生长早期阶段的非主观代理指标,尤其是在拟合微生物生长曲线时。

结果表明,对比分析能够可靠地量化真菌在异质生物基材料上的起始和进展。其与人类感知的一致性、对早期变化的敏感性以及与自动化分析流程的兼容性,使该方法有望应用于非主观、标准化的霉菌易感性测试框架。这些发现为推动质量控制工具的发展奠定了基础,支持可持续保温材料安全融入建筑环境中。

表1 表展示了人类对霉菌生长起始评估的感知结果,以及基于图像的GLCM对比度量分析结果,配合微生物生长曲线。结果显示了10个MBC样本中的每一个。调查参与者确定的霉菌生长平均开始时间(记为td),以及标准误和T中的标准差d.为了确定参与者的选择是否反映了视觉线索的反应,而非随机猜测,对每个样本的反应分布进行了卡方拟合度检验。在原假设下,反应分布均匀,表明没有共同的视觉阈值来检测霉菌。在p<0.05显著水平下,所有案例均拒绝了原假设。GLCM对比度量测得在td显示。t之间的百分比和绝对差d和 λ 分别表示

标本检测到时间 td(小时)t中的标准dt处的对比d滞后时间(λ)T之间的百分比差异d以及 λt的绝对差d以及 λ
1149.2 ± 3.415.26.2138.96.910.3
2160.2 ± 10.647.41.4165.53.35.4
3170.7 ± 10.848.31.7173.11.42.5
4185 ± 1567.11.1160.313.424.7
5172.8 ± 15.770.01.5161.66.411.1
6160.1 ± 6.729.71.5158.51.01.6
7167.1 ± 16.875.11.1151.39.415.8
8168.0 ± 8.035.61.4185.410.417.4
9161.7 ± 6.328.01.6165.62.44.0
10145.3 ± 3.013.22.8145.00.20.3

讨论

本研究中产生的MBC样品的热导率与其他生物基绝缘材料和传统绝缘材料相当[15, 49]。这些结果进一步证明了MBC能够有效减少热传导,因此有潜力作为不同基底和真菌种类组成中不可持续绝缘材料的替代方案[20]。这进一步强调了应对霉菌风险的必要性,否则霉菌可能限制这些材料的采用。

MBCs上的霉菌生长与其他生物基材料的发现一致,反映了其底层成分。木质纤维素基质在菌丝形成过程中部分降解,但为许多霉菌真菌提供了养分来源[50, 51]。当添加水分并保持高湿度,防止材料干燥时;条件适合霉菌生长。这与许多传统绝缘材料(如聚苯乙烯泡沫)形成对比,后者较难生物降解,即使在恶劣条件下也能抵抗霉菌。例如,Klamer等人在包括环境湿度、降雨和水中浸泡的湿润条件下,评估了在矿棉和玻璃棉上接种霉菌孢子后的霉菌生长[52]。经过四周的潜伏期,霉菌仅在表面的液滴中生长,而非物质的定殖。相反,Viel等人在90%相对湿度和30∘C下观察大麻绝缘材料上的霉菌,观察到三个月内霉菌严重生长[53]。同样,Raamets等人发现,在75% RH下孵育一周后,稻草和大麻绝缘材料均开始生长霉菌,且随着相对湿度的增加,易感性也随之增加[54]。Johansson等人确定了多种建筑材料霉菌生长的临界相对湿度[6]。纤维素纤维板的临界相对湿度在75%至80%RH之间,而膨胀聚苯乙烯、聚氨酯、散装纤维素和矿棉的临界相对湿度超过95%,表明许多传统保温材料能够承受极高湿度,以及一些生物基选择如松装纤维素。Lähdesmäki等人在96%至97%相对湿度和20至22∘C的膨胀聚苯乙烯上自然接种时评估霉菌生长,发现即使在90周以上,霉菌覆盖率仍低于10%[55]。Stefanaski等人观察到,当大麻、木纤维和羊毛样品直接接触提供水分的琼脂盐溶液时,霉菌会在60%至70%相对湿度和20 ∘C处形成,其中大麻绝缘材料最易受影响[56]。

由于所用真菌种类、检测方法和环境条件的不同,材料之间的直接比较具有挑战性。此外,同一大类材料中不同制造商材料的敏感性差异,以及使用同一样品的重复报告的差异。一般来说,建筑材料的模具测试需要进一步的表征和标准化。尽管如此,文献与这里报道的发现是一致的。本研究所用的条件比EN 17886标准中的情况更为严重,旨在促进真菌生长以进行图像分析,同时提供高风险情况下霉菌生长的数据。然而,结果可能表明潮湿环境中的泄漏是MBC使用中高风险的情景。更广泛地说,十天内观察到的快速且广泛的增长凸显了常规检测、湿度管理策略以及即使材料隐藏时也能现场监测性能的必要性。该检测最适用于高湿度的急性期。应评估在较温和湿度下的长期生物稳定性。虽然水分减少会限制真菌的生长能力,但在低湿度下,该物质仍是养分储存层,且只要水分恢复,霉菌孢子仍可能长时间休眠[57]。预防高风险情况的策略可能包括测试疏水涂层(可能允许水分流失)或具有抗菌活性的涂层[58, 59]。

霉菌在MBC上生长,因为它们利用材料中的碳和其他养分作为能量来源[17]。本研究所用的霉菌种类为腐生性,因此通过分解有机基质获取养分 [60,61,62,63,64,65]。在用于MBC接种的六种植物中,从肉眼观察中,黑曲霉最为显著。该物种生长迅速,主要定殖者可能在最易获得的养分上超过了其他真菌[66]。霉菌能够在木质纤维素基底(如大麻)上生长的能力已被充分证明,这种材料构成了MBC的主体[67]。目前尚不清楚菌丝体本身是否也包括几丁质和其他真菌成分,也可能作为营养来源。检测纯菌丝泡沫有助于澄清这一点。

此外,先前研究表明,MBC因其多孔结构能够吸收大量水分[68, 69],尽管菌丝体和一些MBC常常具有疏水性[70, 71]。这种水分吸收可能创造有利于霉菌生长的条件,未来工作应评估这些材料的吸湿性,包括高湿度时的水分吸收,如何影响霉菌生长风险。

除了纯菌丝泡沫和复合材料的区分外,MBC的成分很可能影响霉菌生长。大多数MBC由木质纤维素材料制成,这些材料对真菌降解极为敏感,但这些材料如稻草、大麻和木材的成分差异,尤其是木质素和纤维素含量的差异,可能影响霉菌定殖的程度和类型[22, 72, 73]。

在人工制造过程中菌丝体定殖的程度也可能很重要。更高的定殖水平会改变材料的组成,既通过增加菌丝生物量,也可能通过在生长过程中消化更多散块材料,减少易于接触的基质数量。这反过来又会影响霉菌的易感性。由空气菌丝形成的菌丝体皮肤可能为底层主体基质提供一定程度的物理屏障。然而,这层皮肤并不能完全阻止霉菌生长,因为本研究产生的MBC具有表层皮肤,且仍支持霉菌生长。

MBC生产中干燥的程度和灭菌方法也可能通过影响材料的微生物群来影响霉菌的易感性。更密集的灭菌可以更彻底地消除与基底相关的微生物,这些微生物可能包括可能发芽的霉菌孢子。然而,它也可能去除那些可能抑制更不良真菌建立的良性或竞争微生物物种。在自然环境中,材料很少是无菌的,且被多种真菌和细菌群落定殖[74]。因此,这种残留微生物组的组成可能在安装后抑制或促进霉菌生长中发挥作用。了解不同的干燥方案、灭菌方法和定殖后处理如何塑造这些微生物群落,对于解读MBCs的霉菌易感性以及识别可能降低霉菌风险的制备步骤可能非常重要。

在安全使用方面,建筑材料中缺乏针对霉菌生长风险的强制标准化测试这一点值得注意。本研究所用极端条件下的性能并不一定意味着MBC整体上不安全,但这也凸显了当前缺乏一致测试方案本身就是一个安全隐患。这个问题不仅限于MBC,还涉及大多数不需要强制检测的建筑材料。使用生物材料时,其状况需要在湿度升高、可能冷凝或发生泄漏的情况下进行关注。除非有适当的保护或监测,否则应避免在易发生这些状况的环境中使用。此外,还需要实际的现场测试来确定MBC的长期耐久性。评估霉菌生长标准中规定的条件与建筑实际暴露情景的关系也非常重要。这将使标准能够不断完善和扩展,以涵盖更广泛的风险环境(包括模拟润湿事件),并支持这些材料更完整的风险概况的制定。反过来,这将使我能够更明智地决定MBC安全使用地点及可能需要的缓解策略。

随着MBC的不断发展,霉菌风险的优化和评估也不容忽视,尤其是热性能、可持续性及其他材料性能方面。MBC的一个优点是其多功能性和多样性,这可以通过调整基底成分、制造参数和表面处理来提升耐久性。本研究展示的基于图像的方法可以通过支持大量常规和标准化测试,以非主观、更易比较的方式进行。该方法可通过对不同基底类型的对比度指标进行标准化,针对不同材料进行校准,然后用于在多种受控条件下比较性能。

基于图像的霉菌生长评估方法此前主要集中于分段可见菌落和量化覆盖范围。灰度图像识别方法利用灰度阈值和分段计算霉菌覆盖表面的比例,已被应用于动态温湿度周期下的建筑材料,提供了比视觉评分更客观的替代方案[34]。类似的数字图像处理框架也被用于基于空间和频域特征(包括离散傅里叶变换描述符)定义损伤指数,以表征受霉菌影响建筑材料的覆盖率和纹理变化[37]。在木材材料上,颜色分割和基于图像的分析已被用于确定涂层木材的表面覆盖情况,并量化与未涂漆木材及暴露于湿度波动下的木材上霉斑的轻度和表面均匀性变化[35, 36]。与此同时,对生物膜和微生物在非建筑基底上的生长研究通常使用基于图像的指标,包括荧光图像的色彩分割和三维共聚焦分析,来量化结构参数,如面积、厚度和粗糙度[75]。与这些主要基于面积和强度的方法相比,本研究中使用的GLCM对比度指标捕捉的是表面纹理的变化,而不仅仅是可见覆盖,因此非常适合颜色和图案在标本表面变化的异质菌丝复合材料。

以往研究和本研究结果都支持了客观基于图像分析的需求。人类对霉菌发育的评估本质上是主观的,参与者在识别霉菌发病时的差异反映了这一局限性。其他依赖视觉评分的研究也报告了类似的变异性。标准评估系统通常使用少量离散分数的量表(如0–5),而要求多位评估者减少偏见可能不切实际。基于图像的表层变化评估方法有助于实现更一致和可重复的测量。

尽管机器学习方法已被用于对建筑材料上的霉菌进行分类,这些研究显示出良好的自动化检测潜力,但此类方法可能需要大量训练数据集、精心调优和计算资源,这可能限制其在常规测试环境中的应用[76,77,78].本研究采用的方法提供了一种替代方案,优先考虑易用性和简便性,同时仍能提供客观测量,因为它可以通过低成本成像系统实现,且无需专门的训练数据。

基于图像评估霉菌和材料劣化的更广泛文献也支持客观监测方法的优势。使用分割、纹理分析或基于颜色指标的研究显示,自动化或半自动化图像处理能够克服视觉检查带来的一些挑战,并在变化变得清晰可见之前捕捉到早期变化[34, 37, 79, 80]。这些方法对于表面颜色和结构自然变化、可能遮蔽早期霉菌生长的异质生物基材料尤为重要[32]。远程成像和自动分析还为持续监测和现场诊断霉菌问题提供了机会。

在改进和实施这种基于图像的方法时,有几个点需要考虑。首先,这里使用的相机配置成本低廉,且不需要高分辨率;提高分辨率可能进一步提高对霉菌生长起始的敏感度。除了实验室测试场景(可控制照明)外,其他照明相对稳定的环境还包括博物馆或储藏环境,早期发现霉菌非常重要。然而,照明可能存在限制,尤其是在低光环境下,尽管使用闪光灯可以提供均匀的照明。在高风险事件如泄漏后应用中,闪光灯摄影可用于产生一致的图像进行分析。还可以使用基于图像强度直方图或参考色彩目标进行图像归一化的方法[81]。对于常规的长期监测,每天同一时间协调拍摄图像,可能在一定范围内实现均匀的照明。这些实际考量表明该方法在实验室和受控测试环境中更易实施,但当能够实现一致的图像捕获条件,或经过规范化修改时,也有更广泛应用的潜力。

结论

本研究研究了菌丝基复合材料的霉菌易受性,并评估了一种基于图像的定量方法,用于量化异质生物基材料的霉菌发生情况。这些发现为生物基保温材料的耐久性风险提供了宝贵见解,并为更客观的材料评估方案和对易霉材料进行现场监测提供了潜在途径。本研究的三大关键目标如下:

  • 评估菌丝体复合标本在湿润和高湿度条件下对霉菌生长的敏感性:所有MBC标本在暴露于高湿度和湿润环境下均观察到霉菌生长,表明它们在易受潮环境中易受真菌侵染。这些发现强化了在真实暴露场景和标准化实验室测试中对生物基材料进行测试的必要性,并凸显了在环境控制受限时安装后监测的重要性。
  • 开发并测试一种非主观方法,用于追踪非均质材料上的霉菌生长:采用GLCM对比度的基于纹理的图像分析方法成功实现,客观量化与真菌定殖相关的标本表面纹理变化。通过延时摄影捕捉的对比数据与微生物生长动态相符,并提供了可量化的霉菌起始信号。
  • 比较霉菌生长的客观图像指标与人类视觉感知:人类感知起始时间与GLCM衍生滞后时间的比较显示了良好一致性。结果还显示,在某些情况下,GLCM对比剂能在霉菌被人类观察者看到之前就检测到早期表面破坏。这凸显了该方法的预警潜力。这些发现共同支持将基于图像的方法作为生物基建筑材料霉菌生长和发育的非主观评估,并凸显了人类评估的主观性质和局限性。

基于图像的分析为霉菌易感性检测方案提供了有前景的补充,尤其是在生物基和视觉异质材料中,传统主观方法可能不够可靠。该方法具有潜在适用于更广泛的材料类型、真菌种类和环境条件,支持细化起始检测阈值和更广泛的推广。它还适合采用低成本延时成像系统进行原位监测,尤其是在易受潮环境或水渗入事件后。

基于对比剂的追踪技术还可能进一步支持早期材料开发,通过比较抗生物劣化能力并促进产品优化。将此类分析整合进常规产品测试工作流程,有助于开发和采用不仅低碳且在现实条件下具备耐用性的生物基绝缘材料。基于图像的自动化评估还可能助力扩大常规测试工作,有助于对不同生物基绝热产品间霉菌易感性的更一致评估。在材料开发过程中确立安全使用参数,包括关键的相对湿度和温度阈值,并探索实用风险缓解策略,对于确保建筑环境中的安全实施至关重要。

总之,本研究表明基于GLCM的对比分析为评估生物基建筑材料霉菌生长提供了可靠且非主观的工具。其与人类感知高度契合且能检测早期表面变化的能力,支持其作为更广泛霉菌评估方案一部分的价值。还对MBC在高湿度和潮湿条件下霉菌生长的风险进行了表征。此处展示的工具有助于MBC的特性分析,尤其是在将霉菌生长风险缓解纳入材料开发工作时。随着生物基材料日益融入建筑实践,这类稳健且标准化的检测方法将成为确保其长期性能和安全性的关键。

数据可用性

本研究期间生成和分析的数据集可由通讯作者合理请求提供。

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