挑战下的冷静：猴头菇菌丝体在人体免疫细胞中的免疫平衡与减压作用

摘要

黄锥虫是一种药用蘑菇，因其神经保护、免疫调节和抗氧化活性而在健康行业中被重视。虽然许多菌丝体和子实体中的提取物和生物活性化合物已被鉴定，但驱动其效应的机制尚未完全明了。本研究研究了鳃瓜菌丝体（HDLM）在人类外周血单核细胞（PBMC）中的转录组和蛋白质水平效应，以及抗氧化和铁螯合活性。一种商业化的鹩氏菌子实体提取物（FBE）声称含有高β葡聚糖含量，被纳入一组检测，以比较菌丝体与子实体成分之间的免疫相关结局。HDLM激活了多种与免疫和氧化应激相关的转录本及通路，表现出显著的抗氧化活性，并在LPS挑战期间持续减少IL-1β、TNF-α和IL-8，同时保持低基础细胞因子表达，表明具有靶向免疫调节活性。当LPS挑战时，FBE几乎使IL-1β的产生翻倍，而HDLM则显著减少了该应激介质的产生。与FBE相比，HDLM还表现出增强的铁螯合能力。根据组织来源和制备方法，不同鹩鱼材料可能增强或抑制应激反应，凸显了在免疫挑战条件下，特别是在细胞因子调控方面，需要进一步对比鈽鱼补充剂的生物活性和安全性。

关键词：铁尾豆;菌丝体;子实体;摘录;免疫调节;抗氧化剂;免疫;细胞因子;β葡聚糖

1. 引言

银豆，通常称为猴头菌，是一种广泛栽培且极受欢迎的美食和药用真菌，以其多样的生物活性成分闻名，这些成分支持多种积极的健康效果。在功能性蘑菇行业中，鹃鹃菌主要因其神经保护特性而受到重视，众多研究表明其在神经退行性研究环境中支持大脑功能、促进神经发生、缓解情绪障碍以及维持神经元功能的潜力[1,2,3,4]。此外，多种鹩角杆菌组织、提取物和组分在动物模型和人体临床试验中均显示出显著的抗氧化活性、肠道微生物群组成调节及抗癌效果[5,6,7,8,9,10,11]。虽然鹩角杆菌被赋予了众多健康支持效果，但鹩孢杆菌菌丝体在补充剂行业中可能被低估的一个好处是它支持健康的免疫系统。

在鏾鱼中已鉴定出许多生物活性分子家族，包括揶烯酸、赫里辛、赫里辛、肽以及多糖类如β葡聚糖[2,6,12,13,14]。重要的是，不同的胡桃螺旋杆菌组织和发育阶段会产生不同的化学特征，子实体以赫里松为特征，菌丝体则独特地产生刺针霉素[14,15,16]。以往对胡桃树成分的研究显示，球松素（但不包括）在神经模型中持续诱导神经生长因子（NGF）表达[2,17]。因此，本研究探讨了不同胡桃苗组分是否也表现出不同的免疫影响。

在确认了以提取的猴头菇菌丝体（HDLM）形式提取的假说，能够诱导人类外周血单核细胞（PBMC）中的清晰转录组免疫调节后，研究人员还研究了由该鸢鱼组分率诱导的细胞因子蛋白反应，以及声称高β糖含量的子实体提取物（FBE）。对中心炎症细胞因子靶点进行了筛选，比较其在基础和炎症条件下的结合，显示HDLM促进了平衡的免疫反应，在LPS挑战下显著降低炎症性白介素1型β（IL-1β）产生具有独特效果。HDLM还表现出显著的抗氧化和铁螯合作用，通过抗氧化和亚铁螯合测定进行了评估。相比之下，FBE在受挑战下表现出显著的炎症细胞因子表达，且在所有检测浓度下铁螯合活性显著降低，凸显了不同组织类型和提取方法中获得的鹩角杆菌组分在免疫调节和应激淬灭作用上的差异。

2. 材料与方法

2.1. 样品制备

通过混合50克宿主防御猴头粉（HDLM;鳃瓜菌丝体和发酵糙米生物量;Fungi Perfecti， LLC，美国华盛顿州奥林匹亚）与50克95%乙醇和50克超纯水一起。样品在室温下浸泡72小时，然后以600×克离心10分钟，直到上清液被倒出。这一离心步骤反复进行，直到颗粒几乎干燥。在上清液回收极大后，样品通过0.2微米聚丙烯滤芯称重，然后在−80°C下冷冻。 样品被冻干至干燥，转移到新的无菌管中，并在室温下保存，直到在水中、DMSO或PBS中重新组装进行检测。

在IL-1β ELISA和铁铁螯合能力测定中，采用了一种由中国来源材料制成的商业化鹩氏杆菌子实体粉末（FBE），以比较不同组织类型（因此不同化合物组成）相关的生物疗效结果。购买时，子实体材料被制成热水提取物，并重新悬浮在每次检测的适当溶剂中，以保持其宣传的30%β葡聚糖含量。虽然像Megazyme这样的酶测定试剂盒常用于定量真菌β-葡聚糖，但这些方法主要区分β-1,3和β-1,4连接的葡聚糖，无法区分来自酵母和蘑菇来源的β-葡聚糖。因此，样本中真菌β-葡聚糖的确切大小、组成及相对比例无法精确定量。

2.2. PBMC用于RNA测序的培养

PBMCs被选用于研究HDLM治疗对全球免疫的影响，因为它们代表了异质性的免疫细胞群体，能够进行体外人体细胞系统中细胞因子反应和应激相关通路的机制性评估。PBMCs（美国弗吉尼亚州马纳萨斯，PCS-800-011）从低温保存中取出，转移到RPMI 1640的T75烧瓶中（ATCC，30-2001），并补充10%胎儿牛血清（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯，F1051-100ML），该血清经过热灭活，在5%一氧化碳中37°C孵育

₂大气层24小时，然后重新播种到12孔板中。经过24小时的培养后，细胞接受了处理及额外培养基，并继续培养24小时。采集时，板材在80×克下离心6分钟，然后吸入培养基，以便用细胞刮刀取出细胞并移入无菌的1.5毫升微离心管。管子在2000×克下离心30秒，再次吸入细胞培养基，随后将细胞颗粒冷冻于液氮中，储存于−80°C。

开始提取RNA前，表面和工具均使用RNaseZap清洁（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆ThermoFisher，AM9780）。使用RNeasy Mini Kit（荷兰芬洛Qiagen，74104），在通过弹动松动细胞沉淀后，向每个微离心管加入350微升RLT缓冲液，并通过涡旋法溶解细胞1分钟。上清液被转移到新的无菌1.5毫升微离心管中，遵循制造商推荐的哺乳动物细胞提取程序，包括将柱子放入新的收集管并在13,000×克下离心1分钟后进行洗脱。洗脱时，向柱中加入30微升无RNase水，并在室温下培养1分钟后再进行。在DNA酶消化前，通过光谱光度法确定了RNA质量（A260/280比率）和样品浓度。

为进行DNase消化，30微升洗脱RNA加入3微升反应缓冲液和3微升DNase I（ThermoFisher，EN0521）。样本在37°C下培养30分钟，随后加入3微升50 mM EDTA，再在65°C培养10分钟。所有样本均储存在−80°C，并用干冰装在干冰上运往Novogene公司（美国加利福尼亚州萨克拉门托），进行mRNA测序（RNA-Seq）。

2.3. 细胞存活能力测试

在培养PBMC进行RNA提取之前，进行了MTT测定（ATCC，30-1010K），以根据细胞存活率优化处理浓度。使用384孔板，每种处理浓度n=6个重复孔。复制最大化基于板块空间，所有检测至少有n = 4次或更多。MTT检测按照制造商的试剂盒说明进行，但将反应体积从110微升减少到55微升，以便在384孔板中进行测定。处理后的细胞在37°C的5%一氧化碳中孵育

₂气氛浸泡4小时，以最有效地溶解福尔马赞染料。吸收度读数记录在570和660纳米，最终样品值通过从570纳米处减去660纳米值，再从其他样本中扣除介质空白控制的平均值来计算。相对于PBS载体对照进行了细胞存活率的评估。

2.4. RNA测序与分析

PBMCs采用转录组学方法，评估免疫相关基因和通路对HDLM的整体反应。只有当总RNA含量超过100 ng且光度A260/280比值达到1.95或以上时，提取的样品才可进行测序。使用了诺沃基因的mRNA-Seq服务，该服务在Illumina NovaSeq X-Plus平台上进行，该平台的读段长度为对应150碱基对。每个样本至少生成了2000万对读段，并与人类参考基因组Homo_sapiens_Ensemble_94比对。RNA-Seq数据汇总于表S1。

Novogene的分析平台NovoMagic被用于通过主成分分析（PCA）评估数据质量和重复级变异性，并生成差异表达基因（DEG）列表和点图，总结KEGG和反应组通路。诺沃基因默认的DESeq2分析，采用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）修正，调整p值（padj）截止值为≤0.05，用于识别显著的DEG和通路结果[18]。RStudio 2024.12.0（R 4.2.2）用于创建柱状图、火山图和热力图。

2.5. 细胞因子活性检测

作为更高分辨率、蛋白质水平的转录组免疫反应确认，细胞因子ELISA在基础和炎症条件下进行，以深入了解HDLM和FBE治疗的免疫调节作用。低温保存的标准人类PBMCs（ATCC，PCS-800-011）经过解冻、离心，并用37°C RPMI 1640培养基清洗，以去除用于冷冻保存的DMSO物质。细胞在T75瓶中过夜浸泡15毫升加热的RPMI 1640（10%胎儿牛血清），以从冻解过程中恢复。用0.4%的锥蓝染色并稀释1×PBS，通过血细胞计确定了可存活细胞计数。经过T75瓶内24小时的生长阶段后，细胞于2×10转移到96孔板上

⁶每孔的细胞。处理剂在播种后约24小时引入，处理后孵育18–24小时，然后以100×克离心分离板6分钟。培养基被抽吸并通过ELISA进行细胞因子分析。每次细胞因子检测均作为独立实验进行，使用新鲜制备的PBMC培养物，每个重复对应一个独立的培养孔。使用市售的白细胞介素8（IL-8;美国明尼阿波利斯R&D Systems，DY208-05），白介素1受体拮抗剂（IL-1RA;R&D Systems，DY280-05）、IL-1β（BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥，437004）、肿瘤坏死因子α（TNF-α;BioLegend，430201年），以及白介素13（IL-13;研发系统，DY213-05）。所有ELISA均按照制造商的说明进行运行。仅IL-8使用PBS缓冲区替代指定的TBS缓冲区;其他所有套件均未进行缓冲液替换。所有ELISA均使用PBS作为样品溶剂和载体对照，唯独TNF-α作为初始剂量反应筛选并使用DMSO。

2.6. DPPH测定

为补充免疫和应激相关通路的转录组评估，进行了DPPH自由基清除分析，以评估与HDLM相关的一般抗氧化剂相关活性。在95%乙醇中制备了100 μg/mL的DPPH试剂（Sigma-Aldrich，300267），通过将60微升DPPH原料与40微升无菌水混合，形成了校准的库存溶液。所得溶液被加入384孔板的单孔孔中，光度测量为517纳米，并校准使吸光度降至1.0至1.1之间。抗坏血酸作为正对照，使用无菌水作为空白，最大信号对照则包含DPPH试剂。所有控制组均以每井100微升负载。HDLM处理液在无菌水中连续稀释后，以每孔75微升体积加入384孔板。384孔板在517纳米处读取以评估背景，然后向每个孔添加25微升DPPH存量，返回读板器，在读板处以517纳米读数每5分钟一次，持续60分钟，读点间振动。修正后的吸光度值是通过从所有其他井中扣除60分钟的平均背景吸光度获得的。自由基清除活动百分比通过从最大信号控制中减去样品吸光度，除以最大信号控制，再乘以100计算，其中最大信号控制定义为60分钟时DPPH试剂的平均吸光度。

2.7. 铁铁螯合能力评估

根据对氧化还原相关途径的转录组分析，铁亚铁（Fe²⁺评估了样本的螯合活性。与[19,20]类似，通过测量因抑制紫色铁-铁导致的颜色强度降低，量化HDLM和FBE的螯合活性²⁺复杂。所有样品稀释、组分、空白控制和最大信号控制均使用无菌水。加入了双倍EDTA序列稀释（100 μM–0.78 μM），以建立标准曲线，并以EDTA μM当量表达样品铁螯合能力。在1.5毫升微离心管中，向500微升样品、空白或最大信号控制管中加入900微升无菌水。100微升，含0.6毫米FeCl₂（ThermoFisher， 389350250）被添加到所有样品和对照中，除了空白样品，该样本添加了100微升水。反应管被剧烈涡旋，然后在室温下孵育10分钟，每2分钟进行额外涡旋。在黑暗中，所有反应管中加入100微升5毫毫米铁素（ThermoFisher，AC410570010），短暂涡旋后反应转移到96孔板，每重复孔200微升。该板在室温下在黑暗中孵育10分钟，吸收率在562纳米处用分光光度测量。

为了确定样品的亚铁螯合百分比及后续EDTA μM等效值，将平均空白吸收值从所有其他样品和对照值中减去。样品的铁螯合百分比通过用平均最大信号控制值减去样品吸光值，再除以平均最大信号控制值，再乘以100计算得出。通过将EDTA控制浓度与相应的亚铁螯合百分比绘制出EDTA标准曲线，该标准曲线方程用于确定每个样品的平均EDTA μM当量值。

3. 结果

3.1. 细胞培养优化与细胞存活性测试

为优化处理浓度，首次进行了MTT检测，评估125 μg/mL至3.9 μg/mL范围内稀释序列的HDLM（溶解于PBS）中的细胞存活能力。值得注意的是，四种治疗浓度的反应超过载体对照组，表明HDLM可能增强细胞代谢活性或存活率（图1A）。基于结果，选择了62.5 μg/mL的RNA-Seq HDLM处理浓度，以平衡高处理浓度与细胞存活率超过100%的平衡。

图1。（A） 经MTT测定评估的人类外周血单核细胞（PBMC）相对于载体（PBS）的细胞存活率百分比（n = 每处理浓度6孔;显著性评估为载体对照、双尾t检验、方差不等，p < 0.01： **， p < 0.001： ***）。（B） 对HDLM和载体处理样本进行主成分分析（PCA），基于转录组聚类模式（n=6）评估这些处理组之间的相似性或差异。（C） HDLM处理PBMC相对于Vehicle的火山图，显示基因表达差异的大小（对数）
₂FoldChange）与统计显著性（−log₁₀(pval））。统计学上显著结果以红色表示表示下调基因，蓝色表示上调基因（n = 6，DESeq2，p adj < 0.05）。 （D） HDLM处理中相对于载体（n = 6， DESeq2， padj < 0.05）的前10个按折叠变化（FC）上调和下调基因。

3.2. HDLM对人类PBMCs的转录组影响

对RNA-Seq数据进行PCA以可视化全局基因表达模式，结果显示HDLM和载体样本通常分开聚集，显示了与载体对照组相比，使用HDLM处理的PBMC基因表达谱明显改变（见图1B）。具体来说，HDLM处理的复制体主要聚集在象限IV，而载体复制体则倾向于聚集在象限I和象限II的交界处。PC1和PC2分别占14.87%和12.34%。在比较HDLM和载体处理PBMC的表达谱时，发现基因表达明显转变，339个基因显著上调，39个显著下调，显示HDLM处理引发广泛的转录激活（DESeq2分析，padj < 0.05;图1统计学上最显著的结果包括格林（AGRNs;Padj < 8.28 × 10⁻⁹核受体亚家族1，H组成员3（NR1H3;Padj < 3.30 × 10⁻⁸）、等离子酶原激活剂尿激酶受体（PLAUR;Padj < 1.37 × 10⁻⁷），以及基本的螺旋环螺旋家族成员e41（BHLHE41/DEC2;Padj < 1.57 × 10⁻⁷).在炎症期间调节细胞色素C氧化酶的转录本中，最为强有力的包括（MOCCI/C15orf48;折叠变化（FC）= 9.28）、白介素8（CXCL8/IL-8;FC = 7.24），以及IgA受体的Fc片段（FCAR;FC = 7.04;图1D）。此外，下调最严重的转录本还包括bolA家族成员2B（BOLA2B;FC = −11.45），SOS1 内含子转录本 1（SOS1-IT1;FC = −3.19），以及β-1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶3（B4GALNT3;FC = −3.14;图1D).

DEG的KEGG通路富集分析显示了多条显著富集通路（padj < 0.05），包括免疫相关及应激信号通路，如破骨细胞分化、吞噬体、铁消亡、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、IL-17信号、T辅助17（Th17）细胞分化、核因子κ-活化B细胞轻链增强子（NF-κB）信号、Toll样受体（TLR）、C型凝集素受体信号以及核苷酸结合寡聚结构域样（NOD样）受体通路（图2A）。其他富集通路包括与传染病相关的通路（如疟疾、结核病、利什曼病和军团病）、自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、炎症性肠病和系统性狼疮相关信号传导）以及与病毒相关的免疫反应（如卡波西肉瘤相关疱疹感染，以及病毒蛋白与细胞因子受体的相互作用）。

图2。（A） HDLM处理的PBMC相对于载体的KEGG和（B）反应组点图（n=6，DESeq2，p对称<0.05）。（C）HDLM处理PBMC中识别出的免疫相关差异表达基因（DEGs）与载体（n=6，DESeq2，p副对<0.05）。 （D） 细胞因子-细胞因子受体相互作用KEGG通路图谱中的IL-4样和CXC亚家族切片，HDLM DEGs以FC值突出显示（n = 6，DESeq2，p adj < 0.05）。

显著富集（padj < 0.05）反应组途径分为若干功能类别。先天免疫激活通路包括中性粒细胞脱颗粒、Fc伽马受体（FCGR）激活、趋化因子受体结合趋化因子，以及内胚体TLR的运输和处理（图2B）。与氧化应激和抗菌活性相关的通路占据重要地位，包括噬菌细胞中的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）生成、NADPH氧化酶的RHO GTP酶激活以及ROS的解毒。细胞因子信号传导也表现强烈，IL-4和IL-13信号富集，白介素信号通路更宽广，对应HDLM处理后IL-13蛋白的轻度但显著诱导（见图S1）。铁代谢和细胞运输途径如转铁蛋白胞吞与循环，以及铁的摄取和运输也得到了强化。

总体而言，免疫相关细胞过程在富集通路中代表性最高。具体来说，显著的转录反应包括细胞激素相关候选体（如CXCL8/IL-8、IL4I1、IL18、IL18BP、IL13RA1和IL1R1）、多种CXC基序趋化因子配体（如CXCL1、CXCL3、CXCL12和CXCL16）、干扰素受体（如IFNAR1、IFNGR1和IFNGR2）以及免疫细胞表面受体（如CD14，CD44、CD81和CD82）。图2C汇总了在HDLM处理的PBMC中识别出的重要免疫相关DEGs，表S2中包含更全面的列表。图2D显示细胞因子-细胞因子受体相互作用KEGG通路中受HDLM影响最深的两部分的FC值：IL-4样细胞因子和CXC细胞因子。IL-4样通路段尤为活跃，HDLM处理后近一半下游靶点上调。

3.3. 基础和炎症条件下的细胞因子调节

为进一步支持转录组分析中发现的HDLM免疫调节效应，在基线和LPS诱导炎症条件下进行了细胞因子ELISA检测。在基础条件下，HDLM治疗引发IL-1RA的统计学显著且剂量依赖性增加，而IL-8和TNF-α表达保持不变（见图3A、B、D）。在炎症条件下，HDLM显著降低IL-8表达并显著抑制TNF-α，最高浓度几乎完全抑制了该免疫反应（见图3C，E）。

图3。HDLM处理的人类PBMC在基础和炎症条件下的细胞因子蛋白反应。（A） IL-1RA在基础条件下（n = 6）。（B，C）基础（B）和炎症（C）条件下IL-8（n=4）。（D，E）基础（D）和炎症（E）条件下的TNF-α（n=4）。在所有情况下，显著性均通过方差不等的双尾t检验（p < 0.05： *， p < 0.01： **， p < 0.001： ***）进行评估。

鉴于HDLM在转录组分析中与这些显著蛋白反应同时观察到的全球免疫调节效应，FBE被纳入IL-1β ELISA中，直接比较组织类型和化学成分如何影响鹈豆杆菌治疗的免疫调节效果。在基础条件下，HDLM和FBE均支持IL-1β表达的统计可检测但幅度较低的变化，且无明确的剂量-反应关系，表明存在轻微免疫启动或免疫激活有限（图4A）。然而，在炎症条件下，HDLM显著降低IL-1β表达，而FBE则强效且依赖剂量诱导IL-1β表达，顶端浓度的IL-1β表达超过LPS对照组的两倍多（见图4B）。

图4。在基础（A）和炎症（B）条件下，使用HDLM或H. erinaceus果实体提取物粉末（FBE）处理的人类PBMC中IL-1β蛋白反应（n = 4， p < 0.05： *， p < 0.01： **， p < 0.001： ***）。

3.4. 抗氧化和铁清除能力

由于HDLM处理后检测到大量抗氧化剂KEGG和反应组，该提取物的抗氧化活性通过DPPH进行了评估。DPPH检测显示，HDLM表现出显著且对剂量敏感的自由基清除活性，超过所有测试浓度最大控制值的75%（p < 0.001;图5）。尽管该真菌的抗氧化活性已被充分验证，RNA-Seq发现了HDLM的更新颖的铁代谢信号，同时也发现了与氧化还原和铁凋亡相关的强健结果，促使与FBE进行比较，以确定该反应是否更强地关联于任一提取物。HDLM在每种测试浓度下均表现出显著高于FBE的铁螯合活性，最低浓度的折叠差异超过6倍，最高浓度超过2倍，所有剂量下铁螯合效果持续更强（p < 0.01;图6）。

图5。通过DPPH测定评估HDLM的抗氧化能力（n=8;显著性相对于最大信号控制、双尾t检验、方差不等，p<0.001：***）。

图6。HDLM和FBE的亚铁螯合能力，以EDTA μM当量表示（n = 5;显著性检验通过比较HDLM各浓度与等效FBE浓度进行，双尾t检验，方差不等，p < 0.01： **， p < 0.001： ***）。

4. 讨论

4.1. 诱发的HDLM激活与免疫反应抑制

在健康人体免疫细胞中治疗HDLM持续促进免疫系统的平衡调节，尤其是先天免疫反应。共识别出152个广泛免疫相关差异表达转录本，除12个外均被发现上调（见表S2）。研究发现了与免疫调控信号相关显著（padj< 0.05）通路富集，蛋白质水平证据还表明免疫反应具有情境依赖性调节，且根据LPS诱导炎症的有无，参与模式各异，表明受挑战免疫系统的平衡。与先天免疫相关的富集通路包括吞噬体、溶酶体、中性粒细胞细胞外陷阱形成、白细胞跨内皮迁移、中性粒细胞脱颗粒以及多个模式识别受体系统。PBMCS中通常缺乏中性粒细胞，但可被细胞因子如CXCL8/IL-8（FC = 7.24）激活，同时也被特定类型和浓度的ROS和RNS激活[21]。中性粒细胞及其他免疫效应因子如巨噬细胞大量产生ROS和RNS以破坏病原体，但在更具体剂量下，它们作为信号分子激活和调控这些细胞[22]。细胞因子和ROS/RNS信号传导很可能是这些中性粒细胞相关观察的基础，因为ROS/RNS的产生和解毒过程中反应组通路显著富集，包括ROS、吞噬细胞中的RNS产生、RHO GTP酶激活NADPH氧化酶以及ROS的解毒。

HDLM治疗后先天免疫转录本激活通过诱导抗炎蛋白（如IL-1RA）以及极少参与经典炎症信号（如TNF-α、IL-1β和IL-8）来平衡。ELISA结果显示，HDLM在基础条件下未诱导显著量的TNF-α或IL-8蛋白，且在炎症条件下显著降低了这两个靶点的表达（见图3）。虽然IL-8转录本在基础条件下显著上调，但蛋白质水平保持不变。由于IL-8蛋白具有强大的免疫受动特性，其表达在转录前后都受到高度调控，以微调免疫反应，并且需要其他炎症信号的存在才能实现最大表达[23,24]。这一动态表明HDLM可能激活人类免疫细胞，增强免疫准备度，而不会在必要时触发促炎蛋白的产生，这种反应也被注意到其他免疫效应者[25,26]。

同样，虽然某些HDLM浓度在基础条件下略微增加IL-1β蛋白表达，但这些增加为<5 pg/mL，菌丝体在炎症条件下IL-1β的减少幅度更大且显著（见图4）。这一效应部分反映了HDLM处理后白介素1受体1型（IL1R1，FC = 1.75）转录本的增加，因为IL1R1是IL-1α和IL-1β的受体，蛋白质增加可能导致炎症信号分子更活跃[27]。IL-1RA作为IL-1受体拮抗剂，在竞争性地阻止IL-1β与其受体结合，强有力诱导，这很可能解释了基础条件下观察到的低IL-1β蛋白水平[28]。此外，IL-1RA已知会抑制IL-8表达，这也可能导致基础条件下IL-8蛋白诱导不足[29]。白介素-1受体相关激酶3（IRAK3，FC = 1.81）可能进一步促进这一动态，因为它已知能抑制IL-1和NF-κB轴的效应[30,31]。

编码dectin-1的C型凝集素结构域（CLEC7A， FC = 1.44）适度上调。Dectin-1识别真菌β-葡聚糖，参与典型的NF-κB通路，影响Th17分化和IL-17介导的中性粒细胞招募等下游通路[32]。Th17分化受到严格调控，过度激活可能导致致病性炎症;干扰素β（IFNβ）通过由干扰素α和β亚基1（IFNAR1，FC = 1.35）编码的蛋白质信号传递，由dectin-1的结合引导，可能有助于调节Th17反应和IL-1β表达[33,34]。这种调节动态得到了HDLM治疗在基础条件下缺乏IL-1β蛋白的支持，同时还结合了唾液酸结合Ig类凝集素10（SIGLEC10，FC = 4.17），后者作为抑制受体，选择性抑制对病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的免疫反应。 以及C型凝集素家族4成员E（CLEC4E/Mincle，FC = 5.75），这是一种强抗炎信号，促进T辅助细胞2（Th2）的分化和炎症性T辅助细胞1（Th1）的抑制[35,36,37]。此外，白介素4诱导的基因1（IL4I1）的强上调;FC = 4.37）以及白介素-4和白介素-13信号显著富集，表明IL-4通路被激活;IL-4是抗炎Th2细胞分化核心正反馈回路的一部分，因为它既由这些细胞产生，也调节其作用[38,39]。虽然在病原体挑战期间过量诱导Th2可能不理想，但在基础条件下，这明显反映了炎症信号的减弱。这种免疫参与和抑制靶点的协调上调，可能为HDLM的作用机制提供见解。

4.2. NF-κB信号传导与适应性免疫反应

与其他关键免疫调节轴一致，HDLM治疗后NF-κB通路的调节平衡。两种NF-κB亚基转录本，NFKB1（典型NF-κB通路）和RELB（非典型NF-κB通路）在多种NF-κB抑制剂下以相似水平表达，表明该通路被精细激活以避免炎症过度参与。先前研究表明，NF-κB的激活可以与NF-κB抑制剂的刺激同时发生，从而提供高度调控的反应，从而促使特异性免疫参与或整体抗炎作用[40,41]。由于IL-8和IL1R1转录本与NF-κB激酶亚基ε抑制剂（IKBKE和NFKB1 = 1.35）上调，HDLM处理后预期NF-κB通路活性符合规范性，[42]。IL-8的产生由典型的NF-κB通路驱动，反过来以正反馈回路强化正规的NF-κB激活。同样，IL1R1的增加也增强了正统通路的激活，促进下游免疫效应物的生成[23,43,44,45]。然而，前述抗炎蛋白结果，包括炎症条件下IL-8诱导的缺失，表明典型NF-κB通路的激活与抵消抗炎信号协同发生[46]。温和上调的NF-κB抑制剂ε（NFKBIE，FC = 1.47）是一种细胞质NF-κB抑制剂，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4，FC = 1.33）通过其与抗氧化途径的参与，也已知能抑制NF-κB信号传导[47]。此外，NF-κB通路的非典型激活明显迹象，有助于调控多种免疫功能，包括抗病毒先天免疫、树突状细胞抗原处理及呈递T细胞，以及B细胞激活[48,49,50]。TNF受体超家族成员1B（TNFRSF1B，FC = 1.21），一种非典型的NF-κB激活剂，以及RELB（FC = 1.53），一个核心非典型的NF-κB亚基，在HDLM处理后均被上调[46]。

该治疗还似乎通过先天免疫激活的途径支持抗病毒活性。卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的通路富集显著，病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用，同时还伴随着多种与适应性免疫相关的通路层面刺激，包括B细胞受体信号通路、Fc γ-R介导的吞噬作用和FCGR激活。值得注意的是，HDLM处理还显著上调了TLR8（FC = 1.78）转录本，这与内体TLR运输和加工途径富集一致。TLR系统通过诱导IFN-β及其他NF-κB依赖细胞因子，在调控抗病毒和免疫参与反应中起着核心作用[51]。HDLM诱导干扰素-伽马受体两个成分IFNGR1（FC = 1.52）和IFNGR2（FC = 1.67）的转录本表达，同时刺激IFNAR1（FC = 1.35）[52]。IL-18（FC = 2.28），最初被称为干扰素-伽马诱导因子，也已知能驱动IFN活性[53,54,55]。HDLM治疗后表达的免疫激活抗病毒因子与免疫抑制信号结合，如白介素18结合蛋白（IL18BPs，FC = 1.37），这是缓解IL-18效应的关键抗炎因子，以及DNAJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员C5 beta（DNAJC5B，FC = 2.76），该蛋白编码一种在体外对丙型肝炎具有抗病毒作用的蛋白[43，56,57,58]。总体而言，这些结果强调了HDLM治疗能够诱导关键抗病毒效应物（包括干扰素）的产生，同时促进抗炎介质以维持免疫防御的平衡（见图7）。

图7。HDLM在人类PBMC中免疫调节和细胞应激消灭活性的模型。数据揭示了围绕NF-κB/IL-8（紫色）、IL-1（蓝色）和TNF（橙色）轴的调节动态，这些轴同时激活并安抚这些免疫通路。抗氧化活性以绿色表示，虚线表示调控作用较小。

4.3. FBE引发的炎症反应

HDLM介导的人类PBMC中平衡反应似乎无法被FBE复制。虽然FBE在基础条件下仅带来IL-1β轻微增加，但在炎症条件下，它诱导了显著的剂量依赖性IL-1β产生，似乎增强了LPS的炎症效应。真菌β-葡聚糖已知的免疫刺激作用可能因其β-葡聚糖含量而被该样本过度激活，导致活性氧和炎症细胞因子如IL-1β的表达增强[59,60,61]。虽然促炎细胞因子的产生是对微生物入侵的重要反应，但在长期压力的细胞环境中细胞因子过度产生并不理想，可能导致免疫失调或炎症反应加剧[62,63,64,65,66]。这些发现提供了临床前证据，表明高β葡聚糖含量的果实体提取物可能影响免疫细胞中IL-1β介导的反应，凸显了一个潜在机制，值得在体内进一步研究，尤其考虑到临床上存在高多糖提取物可能加剧细胞应激条件下IL-1β相关反应的担忧，支持谨慎使用[64].此外，据报道，分离的真菌β-葡聚糖能增加多种TLR和凝集素转录本的表达，降低关键抗氧化酶转录本的表达，并增强人类PBMCC中的ROS产生[67]。

真菌β葡聚糖及其对dectin-1的结合可能支持训练免疫，增强先天免疫细胞在重复暴露时发出更强反应的能力[33,68,69]。然而，尽管真菌β葡聚糖历来受到关注，β葡聚糖本身可能并非主要的免疫参与成分，而是β葡聚基质中存在的额外分子[70]。例如，多糖-K（PSK）是Trametes versicolor菌丝体中的一种多糖β-葡聚糖片段，具有抗癌效果;然而，负责PSK刺激树突状和T细胞能力的TLR2激动剂被鉴定为该组分内结构上不同的脂质[71,72]。另一项研究显示，异色菌丝体增强了体外人类单核细胞和淋巴细胞的早期活化，而其发酵底物则诱导了促炎和抗炎细胞因子的更大剂量依赖性增加[73]。因此，HDLM的发酵底物成分可能对本研究观察到的免疫调节平衡有所贡献，这与FBE中出现的促炎反应不同。

鉴于HDLM与FBE在蛋白质水平上的差异，FBE显著的促炎活性似乎反映了β葡聚糖驱动的免疫系统失调导致过度激活，而对菌丝体的反应则暗示存在额外的生物活性化合物，抑制炎症信号。有趣的是，正如PSK观察到的，β葡聚糖也能引发有益的免疫反应，凸显了能够可靠定量和表征β葡聚糖的大小、结构和真菌起源的分析方法的重要性，因为功能测试开始揭示不同β葡聚糖组分之间的差异影响。此外，这一动态也表明需要谨慎，因为真菌补充剂行业对日益重要的生物标志物声明的关注可能超过了严格的安全测试和功能检测。要更深刻地理解当下关于真菌成分功效与安全性的审慎讨论，我们可以从历史的镜鉴中获得启示。推荐延伸阅读菌本｜MycoBio写的《真菌学史》，了解人类对真菌的认知如何从神秘传说逐步走向严谨科学，这将帮助我们以更全面、理性的视角看待今天的研发与创新。

4.4. HDLM和FBE的应力淬火能力

铁剥落症是KEGG中最显著的结果之一，是一种由铁过量导致脂质过氧化的细胞死亡，最初表现为线粒体的收缩和破裂[74]。尽管HDLM处理PBMCs会丰富铁代谢相关的反应组通路（图2B），但铁剥落似乎并未被激活。相反，基因调控趋势及伴随的体外抗氧化活性表明，这更可能是基因产物在HDLM处理下被不同调控的结果。由于铁剥落通过ROS机制作用，抗氧化活性可以通过抑制氧化应激来挽救细胞免于铁剥离或完全预防。多种鹩鱼组分和组织类型具有明确的抗氧化活性，HDLM在反应组富集下表现出显著的自由基清除活性和亚铁螯合潜力，促进吞噬细胞中ROS/RNS产生，RHO GTP酶激活NADPH氧化酶，以及ROS解毒（见图2A，B）[6,75]。即使HDLM的处理浓度是RNA-Seq的两倍，也未显著降低细胞存活率，因此铁凋亡的可能性较低（见图1A）。

抗氧化活性也出现在单个基因产物层面。超氧化物变形酶2（SOD2，FC = 3.76），即中央线粒体超氧化物变异酶，对于细胞防御由电子传递链在细胞呼吸过程中产生的ROS至关重要[76]。除了线粒体，HDLM处理还会影响谷胱甘肽过氧化物酶;C15orf48/MOCCI（FC = 9.28）通过增加谷胱甘肽产生促进抗氧化活性，同时与铁消亡负调节因子GPX4（FC = 1.33）的表达同时被强力上调[75,77]。FAM20C，一种高基氏相关的分泌途径激酶（FAM20C;FC = 1.70）在定位前磷酸化还原内质网1α ERO1A，以增强其活性并促进氧化还原稳态的维持[78]。标准细胞铁循环通路的几个组成部分被上调，包括细胞色素B561家族成员A3（CYB561A3，FC = 2.25），该蛋白在单核细胞和B淋巴细胞上表达尤为高，以及STEAP3（FC = 4.68），一种同时靶向铁和铜的金属还原酶[79,80]。此外，抗氧化剂1铜伴侣蛋白（ATOX1，FC = 1.94）促进铜的运输，已被证明通过调节抗氧化活性和DNA修复来保护细胞[81,82]。这种针对多个细胞部位不同ROS的抗氧化酶，为HDLM显著的抗氧化能力提供了有力的机制支持。此外，HDLM相较FBE显著更高的亚铁螯合能力，凸显了菌丝体更高的应力淬灭潜力。总体而言，HDLM通过抗氧化活性结合靶向免疫抑制表现出压力缓解，这很可能促成了其既有的抗炎和免疫调节效果。

5. 结论

总体而言，HDLM促进了平衡且适应性的免疫反应，为潜在的细胞挑战做好准备，同时避免过度激活。值得注意的是，虽然HDLM在转录本层面对许多免疫激活靶点提供了适度上调，但这项研究表明，在健康条件下，轻度的蛋白质激活与在细胞压力下平稳免疫系统的能力相结合，从而降低了若干关键炎症生物标志物的水平。除了免疫平衡和调节作用外，HDLM还通过体外抗氧化测试确认了转录组先导，提供了稳定的抗氧化活性，表明该治疗可能通过不同但互补的机制缓解细胞压力。有趣的是，与FBE相比，HDLM提供了更强的铁螯合活性。此外，FBE未能提供HDLM所观察到的免疫调节平衡，反而导致IL-1β相关应激反应约增加了两倍。这些临床前发现表明，不同的赫里纳斯拟人制剂可能引发不同甚至不同的免疫和应激反应，凸显了功能性蘑菇产品进一步测试的必要性。虽然还需进一步的临床证据以得出更确凿的结论，但现有研究明确表明HDLM能在人类免疫细胞中引发免疫调节和压力消灭作用。

作者贡献

概念化，C.B.和E.D.;方法论，C.B.、E.D.和J.K.;软件、Z.J.B.和E.D.;瓦验证，E.D.和J.K.;形式分析，E.D.;调查，J.K.和E.D.;数据策展，E.D.和J.K.;写作——原始草稿准备、E.D.和C.B.;写作——书评与编辑，E.D.、C.B.、J.K. 和 Z.J.B.;可视化、E.D.、Z.J.B.和C.B.;监督，C.B.;项目管理，C.B.和E.D.所有作者均已阅读并同意已出版的手稿版本。

资金

该研究未获得外部资助。

机构审查委员会声明

不适用。

数据可用性声明

差异基因表达分析的原始数据见表S1。所有数据均可根据合理请求向 chase.b@fungi.com 提供。

致谢

我们感谢Regan Nally、Kyle Meyer、Jacqueline Morgado和Patrick Bennett提供的宝贵见解和支持，并衷心感谢Paul Stamets的支持和远见，这对本项目的实现至关重要。

利益冲突

所有作者均受雇于Fungi Perfecti， LLC，该公司生产真菌膳食补充剂，包括本研究评估的Host Defense猴头菇菌丝体产品。

缩写

本手稿中使用了以下缩写：

HDLM	主防御猴头菇/鹃花粉产品，提取出来
PBMCs（PBMCs）	外周血单核细胞
联邦联邦	市售的鹈鱼果实体提取物声称含有30%的β葡聚糖
空军交通管制委员会	美国字体文化收藏
RNA-Seq（RNA-测序）	mRNA测序
PCA	主成分分析
DEG	差异表达基因
罗斯福	虚假发现率
padj	调整后的p值
FC	折叠变化
TH17	T 助手 17 单元
TLR	托尔样受体
类似点头	核苷酸结合寡聚结构域样
FCGR	Fc伽马受体
ROS	活性氧物种
皇家海军	活性氮物种
PAMPs（太平洋动力学）	与病原体相关的分子模式
DAMPs（DAMPs）	损伤相关的分子模式
TH1	T辅助细胞1
TH2	T辅助2单元
IFN	干扰素
PSK	多糖-K

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